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技術(shù)專(zhuān)欄

淺析免疫共沉淀(Co-IP)原理和詳細實(shí)驗步驟教程

供稿：技術(shù)部

發(fā)布時(shí)間：2022-06-06

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一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。

其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細胞內存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。

目前多用精制的prorein A預先結合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的prorein A就能吸附抗原達到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內結合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。

其優(yōu)點(diǎn)為：

（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；

（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；

（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。

缺點(diǎn)為：

（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；

（2）兩種蛋白質(zhì)的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；

（3）必須在實(shí)驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實(shí)驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。

二、準備工作：

預冷PBS，RIPA Buffer，細胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機

1. 用預冷的PBS洗滌細胞兩次，最后一次吸干PBS；

2. 加入預冷的RIPA Buffer(1ml/107個(gè)細胞、10cm培養皿或150cm2培養瓶，0.5ml/5×106個(gè)細胞、6cm培養皿、75cm2培養瓶)

3. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮下，把懸液轉到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動(dòng)15min（EP管插冰上，置水平搖床上）

4. 4℃，14000g離心15min，立即將上清液轉移到一個(gè)新的離心管中

5. 準備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議剪掉移液器吸頭，尖頭部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠

6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景

7. 4℃，14000g離心15min，將上清轉移到一個(gè)新的離心管中，去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白標準曲線(xiàn)，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個(gè)月）

9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果誘餌蛋白在細胞中含量較低，則總蛋白濃度應該稍高（如10 μg/μl）

10. 加入一定體積的兔抗到500μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因誘餌蛋白在不同細胞系中的多少而異

11. 4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育

12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來(lái)捕捉抗原抗體復合物，4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl"過(guò)渡抗體"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）

13. 14000rpm瞬時(shí)離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，去上清，用預冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有時(shí)候會(huì )破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內部的結合，可以使用PBS

14. 用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）

15. 將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應再次煮5min變性。

RIPA Buffer配制：

RIPA蛋白酶抑制劑

成分	配制方法
苯甲基磺酰氟（PMSF）	用異丙醇配制成200mM的儲存液，室溫保存
EDTA	鈣螯合劑；用H2O配制成100mM的儲存液，PH 7.4
亮抑酶肽（Leupeptin）	用H2O配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存
抑蛋白酶肽（Aprotinin）	用H2O配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存
胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）	用甲醇配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存
激活的Na3VO4	用H2O配制成200mM的儲存液
NaF	200mM的儲存液，室溫保存
RIPA磷酸	（酯）酶抑制劑
注意：在準備做磷酸（酯）酶實(shí)驗的時(shí)候，不加磷酸酯酶抑制劑。

工作液配制：

配制100ml的modified RIPA buffe：

1. 稱(chēng)取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去離子水中，加入900mg的NaCl，攪拌，直到全部溶解，用HCl調節PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存

5. 理論上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應該在使用當天同時(shí)加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中很不穩定，30分鐘就會(huì )降解一半，所以PMSF應該在使用前現加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩定5天。

RIPA蛋白酶抑制劑各種成分在工作液中的終濃度：

三、實(shí)驗流程為：

（1）轉染后24-48 h 可收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min, 細胞裂解液于4°C，最大轉速離心30 min后取上清；

（2）取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1μg相應的抗體加入到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過(guò)夜；

（3）取10μl protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3,000 rpm離心3 min；

（4）將預處理過(guò)的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；

（5）免疫沉淀反應后，在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；

（6）SDS-PAGE, Western blotting或質(zhì)譜儀分析。通過(guò)免疫共沉淀確定結合蛋白

1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。

2．將每毫升細胞懸液轉移到微量離心管中，在微量離心機上4℃以最大速度離心15 min。

3．收集上清（約30 ml）并加入30μg的適當抗體，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物1 h。

4．加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物30 min。

5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復洗5次。最后，用NETN洗一次。

6．吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min。

7．將樣品加入到大孔的不連續SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳過(guò)夜。

8．通過(guò)考馬斯藍染色觀(guān)察蛋白質(zhì)泳帶。

9．從膠上切下目標帶，將其放到微量離心管中，用1ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min。

10．用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫。

11．通過(guò)窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在A(yíng)BI 477A或494A機器上進(jìn)行自動(dòng)Edman降解測序。

四、注意的問(wèn)題：

（1）細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40 或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的 cocktailer。

（2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用

（3）使用對照抗體：

單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類(lèi)單抗

兔多克隆抗體：正常兔IgG

在免疫共沉淀實(shí)驗中要保證實(shí)驗結果的真實(shí)性，應注意以下幾點(diǎn)：

(1) 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；

(2) 要確?？贵w的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會(huì )引起共沉淀；

(3) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。

?CoIP 的原理，其實(shí)和 WB 一樣，就是抗體抗原結合的免疫反應，只要你會(huì ) WB，就能輕松理解 IP 和 CoIP 的原理。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，如果蛋白 B 和蛋白 C 結合的話(huà)，那么用抗體去結合蛋白 B 的時(shí)候，蛋白 C 就能被拉下來(lái)。

抗體的結構是一個(gè) Y 字形，兩頭是 Fab 用于識別抗原，尾巴是 Fc 區域，這個(gè) Fc 區域就能結合 Protein A 或 G。自從磁珠出現之后，CoIP 的操作就變得更加簡(jiǎn)單了，只需要用包被 Protein A 或 G 的磁珠先和抗體結合，然后用抗體磁珠復合體去結合蛋白 B，之后再用 PAGE 膠分離，用 WB 檢測就 OK 了。

Protein A 和Ｇ親和力對比

蛋白A和蛋白G對于不同種屬和不同亞型的抗體結合能力差異如下表所示，蛋白A對兔來(lái)源抗體的親和力較高，蛋白G對于小鼠等部分哺乳動(dòng)物抗體的親和力較高。